Le roman débute sur une promenade entre Madeleine et Guillaume de Viargues. Depuis quelques mois elle est sa maîtresse et, l'amour les unit. Cependant au bout de six mois, elle découvre avec stupéfaction et terreur que Guillaume a comme meilleur ami son premier amour Jacques qui était étudiant en médecine. Guillaume et Jacques se sont connus à l'école. Le premier avait pris sous sa protection le second qui était la risée des autres élèves à cause des origines de sa naissance.
En ce qui concerne la rencontre entre Madeleine et Jacques, elle remonte au soir où la jeune fille s'est enfuit de chez l'homme qui l'hébergeait depuis la mort de son père. Seule et apeurée, elle aborde Jacques dans la rue et le suit. C'est ainsi que commence leur liaison jusqu'au jour où, le jeune homme reçoit l'ordre de se rendre en Cochinchine afin d'y être médecin. Son bateau coula durant le voyage et tout le monde le cru mort. Se retrouvant à nouveau seule, elle commence une nouvelle vie avec Jacques.
Après sa découverte, Madeleine surmonte son émotion, continue sa vie et accompagne Jacques dans la demeure familiale après le décès du père de ce dernier. Là les deux jeunes gens se marient et ont une petite fille qu'ils nomment Lucie. Madeleine est heureuse jusqu'au jour où Guillaume, très heureux, ramène Jacques chez lui après l'avoir rencontré par hasard. Madeleine se sent alors prise au piège, se cache de Jacques et décide de raconter son passé à son mari. Mis au courant, Jacques décide de quitter sa maison accompagné de sa femme et de sa fille. Ils se réfugient dans leur ancienne habitation. Le couple retrouve alors, brièvement, leurs sentiments d'autrefois. Malheureusement la présence de Guillaume hante à nouveau le couple qui, peu à peu, sombre. Jacques repousse même Lucie car il a l'impression qu'elle ressemble à son ami d'enfance.
Ne pouvant fuir plus longtemps, ils regagnent leur demeure et doivent supporter les reproches de leur servante Geneviève, une vieille femme noire qui ne vit qu'à travers le Seigneur. Madeleine décide d'affronter son passé en allant vers Guillaume, mais elle finit par céder et cède, à nouveau, à son premier amant. Dans le même temps sa petite fille succombe à la maladie qu'elle avait contractée peu de temps auparavant.
Devant tant d'acharnements du destin, Madeleine prend la décision de mettre fin à ses jours en s'empoisonnant avec l'une des fioles de l'ancien laboratoire de son beau-père. Jacques n'ayant pu empêcher sa femme de commettre cet acte irréparable devient fou et se met à danser sur son cadavre.

Madeleine Férat est le seul roman que Zola est écrit après avoir conçu la pièce de théâtre intitulée Madeleine en 1865.

L'histoire est sensiblement la même, seuls quelques points différents. Dans la pièce Jacques se nomme Francis, Guillaume devient Jacques et la servante Geneviève devient Véronique. De plus Francis (Jacques) n'est pas orphelin car sa mère, madame Hubert, est toujours vivante.

La pièce et le roman s'achèvent tous deux par la phrase prononcée par la servante : "Dieu n'a pas pardonné".